Chiếc Ki-45 ban đầu được sử dụng như là máy bay tiêm kích hộ tống ném bom tầm xa. Phi đoàn Độc lập 84 sử dụng nó vào tháng 6 năm 1942 để tấn công Guilin, nơi nó đối đầu, nhưng không sánh được, những chiếc P-40 Tomahawk do Đội Phi Hổ (Flying Tigers) sử dụng. Đến tháng 9 cùng năm, nó lại chạm trán với P-40 bên trên bầu trời Hà Nội với kết quả tương tự. Rõ ràng là chiếc Ki-45 không thể tự vệ được trong không chiến trước những chiếc máy bay tiêm kích một động cơ.

Sau đó nó được bố trí tại nhiều mặt trận khác nhau trong vai trò tiêm kích đánh chặn, tấn công mặt đất và tàu thuyền, bảo vệ hạm đội. Thế mạnh nhất của nó là máy bay tiêm kích đánh chặn chống máy bay ném bom. Tại New Guinea, Không lực Lục quân dùng chiếc máy bay này để chống tàu thuyền, vì chiếc Ki-45 được trang bị vũ khí nặng gồm một pháo 37 mm và hai pháo 20 mm cũng như có thể mang hai bom 250 kg (550 lb) trên những đế dưới cánh. Có tổng cộng 1.675 chiếc Ki-45 thuộc mọi phiên bản được sản xuất trong chiến tranh.

Không lâu sau khi được đưa vào hoạt động, Ki-45 được giao nhiệm vụ phòng thủ chính quốc, và nhiều chiếc đã được tung ra chống lại Trận không kích Doolittle, nhưng không có vụ chạm trán nào xảy ra. Trang bị vũ khí rất mạnh của kiểu máy bay này tỏ ra hiệu quả để chống lại các cuộc không kích của máy bay ném bom B-29 vốn được bắt đầu từ tháng 6 năm 1944. Tuy nhiên, tính năng bay của nó không đủ để đối phó những chiếc B-29 vốn hoạt động ở độ cao 10.000 m. Các cải tiến như giảm lượng nhiên liệu và đạn dược mang theo để nhằm cải thiện tính năng bay chỉ mang lại rất ít kết quả, nên cuối cùng chiếc máy bay được dùng trong kiểu tấn công đâm thẳng mang tính tự sát. Năm 1945, các khẩu súng bắn ra phía trước và hướng lên trên tỏ ra có kết quả khi chống lại các đợt ném bom ban đêm, nhưng không được trang bị radar là một thiếu sót. Đến đầu năm 1945, khi phía Mỹ đưa ra các máy bay tiêm kích xuất phát từ tàu sân bay và những chiếc P-51 xuất phát từ Iwo Jima để hộ tống cho những chiếc B-29 bên trên bầu trời Nhật Bản, vai trò của chiếc Ki-45 đi vào kết thúc.

Phiên bản tiếp theo, Kawasaki Ki-45 KAIc, được phát triển đặc biệt cho chiến đấu ban đêm, và được dự tính sẽ trang bị radar bước sóng centimeter trước mũi, nhưng do những khó khăn trong sản xuất nên không thể thực hiện được. Kiểu máy bay này được Lục quân Nhật trang bị cho bốn phi đoàn (sentai) từ giữa năm 1944 cho đến hết chiến tranh, tham gia vào việc phòng thủ chống ném bom ban đêm. Nó đạt được một số thành tích, và một phi đoàn đã ghi được 150 chiến công và bắn rơi được 8 chiếc B-29 Superfortress của Không lực Mỹ.

Trong vai trò tấn công mặt đất chiếc Ki-45 được dần dần thay thế, nhưng không hoàn toàn, bởi chiếc Kawasaki Ki-102, cho đến cuối cuộc chiến.

Sau Thế Chiến II, ba chiếc Ki-45 rơi vào tay của lực lượng Giải phóng quân Trung Quốc. Không như hầu hết những máy bay Nhật chiếm được khác chỉ dùng trong vai trò huấn luyện, ba chiếc Ki-45 được giao các nhiệm vụ chiến đấu, được đưa vào Phi đội 1 của Không đoàn Tác chiến vào tháng 3 năm 1949. Những chiếc Ki-45 này nghỉ hưu vào đầu những năm 1950.